Brad Ford 단백질 정량

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단백질 추출

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 요즘 수확을 막 끝난 상태라 교수님께서 분석용 콩들을 많이 주신다.

 

그걸 다 분석을 해야 하는데 모든 실험의 기초가 되는 작업이 1. 단백질 추출 2. 단백질 정량이다.

 

특히나 이번에 확인해 볼 P34 유전자는 단백질 양이 많이 측정되면 없는 경우에도 있다고 뜰 수가 있어서 실험 전에는 반드시 단백질 정량을 해야 한다.

 
 이번에 교수님께서 주신 콩은 총 26종류였다.

 

 

단백질 추출은 총 2가지 방법으로 나뉘는데

1. Full seed extraction, 말 그대로 콩 전체를 이용하여 단백질을 추출하는 것이고

2. Piece of seed, 종자의 일부분을 잘라내어 추출하는 방식이 있다.

 

 

이번에는 Full seeds extraction을 진행했다.

Full seed는 콩 전체를 막자사발로 곱게 갈아줘야 하기 때문에 조금 더 귀찮고 힘들다.

 

 

1. 봉투 하나당 콩 종자 5알씩 들어있었는데, 그걸 일일이 핀셋으로 종피를 벗겨내고 망치로 부순 후 막자사발로 다 갈아준다.

 
2. Tris Buffer pH8.0을 5mL 넣고 막자사발에서 콩을 곱게 잘 갈아준다.

 

3. 원심분리기에서 4도, 12,000 rpm, 40~50분 진행 후, 단백질층만 분리하여 원단백질 추출한다.
 
 
 
 

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단백질 정량

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 다음날엔 단백질 정량을 실시했다. 앞서 언급했다시피 P34 단백질을 확인할 때에는 단백질 함량을 낮추는 게 P34 유무를 확인하는데 조금 더 유리하다. 따라서 이번에 원단백질을 정량하여 총 1X만큼의 단백질 정량을 실시했다.
 
 단백질 정량 기계도 30 ㎕ 가 넘어가면 측정값이 정확하지 않아서 원단백질을 추출했다면 미리 희석을 통해 단백질 함량을 낮추고 시작을 하면 편리하다. 마이크로튜브에 원단백 10 ㎕ , Tris 30 ㎕를 넣어 총 volume 40 ㎕를 만들고 이를 정량에 이용했다.

 
 그다음 1.5mL 마이크로 튜브를 준비하여 번호를 적고 ddH2O 800 ㎕, Brad Ford Dye 200 ㎕를 넣어 총 volume 1mL를 맞춰준다. 여기에 원단백질 1 ㎕를 넣고 볼텍싱 시켜준다.
 
 여기서 나중에 기준값을 제공해 줄 Blank 튜브도 하나 만들어줘야 하는데 여기엔 원단백질을 제외한 ddH2O와 BFD만 넣어 준비해 준다.

 
 모두 완료되면 컴퓨터를 켜서 Quantification 프로그램을 실행시켜 준다.

 

에러가 많이 나기 때문에 인내심 테스트를 해야 함...

 
 몇 번 껐다 켰다 하다 보면 저렇게 TEST 창이 뜨게 되는데 이러면 절반은 성공했다고 볼 수 있다.

 
 다 완료되면 왼쪽 위에 595nm가 뜰 때까지 껐다 켰다 반복을 해준다.

 

저 파장이 우리가 원하는 단백질을 읽기에 가장 좋은 파장이기 때문이다.

 

 그러고 불러오기에서 Protein Quantification 1을 불러내준다.

 

 기존에 존재하던 값들을 마우스 우클릭으로 Delete all 해준다.

 

 그다음 Blank 하나를 첫 번째 칸에 넣고 Baseline을 클릭해 기준을 잡아준다.

 

 그다음 샘플들을 하나씩 넣으면

 

 그러고 sample을 클릭하면 이렇게 값들이 나온다.

 

한번 측정을 마치고 새로 갈아 끼운 샘플들을 시작하기 전에는 꼭 baseline을 클릭해 기준을 한 번씩 다시 잡아줘야 한다.

 

 우리는 이번에 단백질 10 ㎕를 넣기로 해서 기준을 10으로 1X로 정량 계산을 했다.

 

제일 오른쪽에 있는 숫자가 우리가 넣어야 하는 Tris Buffer의 양이고 단위는 ㎕이다.

 

 새로운 튜브를 준비해서 Tris를 계산한 만큼 넣어주고 단백질은 10 ㎕를 넣어주면 정량이 완료된다.

 

 여기에 들어있는 모든 샘플의 단백질들은 동일한 양의 단백질이 들어있다.

 

다음번에 Western Blot 실험을 할 때 이 측정된 sample들을 이용하면 정확하게 P34의 유무를 알 수 있을 것이다.