DNA 추출 (DNA Extraction)

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DNA  추출

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 2024년 두량(포장)에 있는 개체들 DNA 분석을 하기 위해 저번주에 잎을 따와서 미리 냉동실에 넣어뒀었다.

오늘은 그걸 이용하여 DNA 추출을 진행했다.

 
 DNA 추출을 하려면  잎을 곱게 갈아줘야 하는데,

그냥 잎으로는 곱게 갈기가 쉽지 않기 때문에 액체질소를 이용하여 잎을 동결시킨 후에 갈아줘야 곱게 잘 갈린다.

그래서 미리 액체질소를 4L 받아왔다.

 

(*액체질소 : Liquid nitrogen으로 샘플 잎이 잘 갈릴 수 있도록 동결시켜 주는 역할)

 
1. 스티로폼 박스에 액체질소를 조금 담고 샘플들을 10초 정도 담가 동결시킨 후 갈아준다.

튜브 안에는 샘플들을 잘 갈아주기 위해 메탈볼이 하나씩 들어있다.

 

 2. sample들을 갈아주는 동안 CTAB(Plant DNA Extraction Buffer)를 만들고 500 µl 씩 sample tube에 분주하고 섞어준다.

(CTAB 제조 시 BME는 마지막에 분주하기 -> 넣는 순간 바로 써야 함)

 

(이때, 미리 WaterBath를 켜둔다. 물 온도가 미리 올라가게 하기 위함)

 

(*CTAB : 식물 조직에서 DNA 추출은 polysacchride의 분리를 촉진하는 CTAB를 사용한 Ectraction Buffer 계면활성제로써 세포막과 핵막을 분리시켜주는 역할.)

 

3. 섞어준 샘플 튜브들을 WaterBath에 1시간 (15 min 마다 뒤집어주)

 
WaterBath 할 동안 새 튜브에 번호를 적고, IPA 500 µl를 미리 분주해 둔다. (IPA는 냉동실에 있음)

 

 

4. WaterBath에서 꺼내 5분간 식힌 후, PCI 500 µl를 넣고 5분간 inverting machine으로 섞어준다.

 

 

*PCI : Phenol Chloroform Isoamylalcohol로 주로 단백질의 제거와 정제의 역할을 함.

DNA는 수용액층(상층)에 남고, 단백질은 유기용매층(하층)에 가라앉게 됨.

 
5. 원심분리기에서 4°C, 12,000 rpm, 5분간 원심분리 후, 가운데 층만 targeting 하여 4~500 µl 추출한다.

 

6. 분주해 둔 IPA (Ice Cold Isopropanol) 500 µl에 가운데 층만 targeting 한 sample 500 µl를 넣고 섞은 후 냉동고에 30분 보관한다.

 

 

IPA : DNA 침전 유도를 하는 역할. -20°C Incuvation 시 nucleic acid 응집이 잘되므로 pellet 형성이 잘됨.

(-20°C incubation 시 pellet에 남은 salt를 최소화하기 위해 70% ethanol로 여러 번 washing이 필요함)

7. 원심분리기에서 4°C, 12,000rpm, 5분간 원심분리 후, 상층액은 버리고 80% ethanol 800 µl를 분주한다.

 

 

(*ethanol :  IPA를 넣어 DNA 침전 유도 후 pellet에 남은 salt를 최소화하기 위해 70% ethanol로 여러 번 washing이 필요)

DNA

 

8. 원심분리기에서 4°C, 12,000 rpm, 5분간 원심분리 후, 상층액은 버리고 ethanol을 상온에 휘발시킨다.

(튜브 뚜껑을 연채로 클린벤치에 넣어 바람을 켜놓고 두면 됨)

9. 사용할 땐 3차 증류수를 100µl 넣고 tapping 하며 DNA를 녹인다.  

 

 

 이번에 가져온 샘플들은 상태가 엄청 좋았다.
사진에 보이는 흰색 부분이 DNA인데, DNA가 깨끗하고 선명하게 보여서 작업하기가 편했다.

 

 

 

 

 

 

 

 
 항상 액체질소가 남는데 그냥 버리기 아까워서 오늘은 과자를 사 와서 얼려먹었다.
먹을 때 코에서 연기가 나오는 게 재밌긴 했는데 혀에 달라붙어서 다음에는 조금만 담갔다가 빼야 할 것 같다.

 
 오후에는 프로틴으로 구슬아이스크림을 만들어봤다.
사진으로는 맛있어보이는데 혀에 달라붙어서 혀가 다 까졌다;;
다음에는 안먹을것 같지만 먹게 된다면 조금 식혔다가 먹어야 할 듯...